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Einführung
:::> Tierartbestimmungen
kommt heute eine große Bedeutung zu, sowohl im Rahmen von Qualitätskontrollen als auch im Bereich des Arten- und Tierschutzes; hierzu werden verschiedene Methoden eingesetzt, so z.B. die visuelle und mikroskopische Analyse, die
Elektrophorese (PAGE, IEF), enzymgekoppelte Immunoassays (ELISA), die Kapillar-gaschromatographie derivatisierter Fettsäuren oder die PCR (Polymerase chain reaction). Diese Methoden sind jedoch abhängig vom Vorhandensein
löslicher Proteine, einem relativ hohen Fettgehalt der zu analysierenden Proben oder amplifizierbarer Nukleinsäuren.
:::> Haare und Federn bestehen hauptsächlich aus Keratinstrukturen, nahezu
unlöslichen, fibrillären Strukturproteinen. Die Bestimmung durch visuelle Methoden, einschließlich der mikroskopischen Analyse, ist zeitaufwendig, bedarf eines hohen Erfahrungsgrades und ist aufgrund fehlender morphologischer
Anhaltspunkte oft nicht durchführbar. Der Einsatz der Elektrophorese wird durch die geringe Löslichkeit der Proteine eingeschränkt, die PCR- Analyse gestaltet sich ebenfalls schwierig, da mit dem Fortschreiten der
Keratinisierung und dem Tod der Zellen die Verfügbarkeit brauchbarer Nukleinsäuren stark herabgesetzt ist. Zudem werden diese oftmals durch chemisch-physikalische Weiterbehandlung der Ausgangsstoffe geschädigt oder zerstört.
Prinzip der SIAM- Methode
:::> SIAM basiert auf der Tatsache, daß Proteine durch ihre Aminosäuresequenz charakterisiert sind. Diese Sequenz ist genetisch festgelegt und variiert zwischen den einzelnen
Arten. Die vorhandenen Proteine werden mittels spezifischer Enzyme zerlegt, wobei die Spaltstellen durch deren Aminosäuresequenz festgelegt sind. Die so entstehenden Fragmente zeigen Unterschiede in Größe und Gewicht, abhängig
vom speziesspezifischen Aufbau der Proteine. Aufgrund des hohen Gehaltes an repetetiven Sequenzen entstehen große Mengen sowohl spezifischer als auch unspezifischer Peptide.
 In einem zweiten Schritt werden diese Peptide mittels der hochsensitiven MALDI-TOF
-Massen-
spektrometrie aufgetrennt; die Spektrogramme zeigen Peakmuster, welche den zugehörigen Molekular-
gewichten der Peptide zugeordnet sind. Diese Peaks werden auf artspezifische Muster hin analysiert.
 Die Frequenz unterschiedlicher Massenpeaks wird für jede Art aus mehreren individuellen Massenspektren errechnet. Auch die Intensität einzelner Peaks wird im Rahmen der
qualitativen und quantitativen Analyse berücksichtigt.
Alle bisher untersuchten Tierarten konnten anhand der artspezifischen Muster sicher und eindeutig bestimmt werden.
Beispiele bisher untersuchter und charakterisierter Tierarten
Vögel: Gans, Ente, Eiderente, Huhn, Fasan, Truthahn
Säugetiere: Hund, Katze, Lama, Alpaca, Kamel, Cashmere, Mohair, Schaf-
wolle, Merino, Chekiang,Yak, Hamster, Iltis, Bisam, Nerz, Wasch-
bär, Marderhund, Kaninchen, Fuchs
:::> SIAM erlaubt die schnelle und sichere Identifizierung von Haar- und Federproben. Voraussetzung ist jedoch das
Vorhandensein korrespondierender Standards. Diese Referenzmaterialien müssen je nach Fragestellung sorgfältig ausgewählt werden, da durch die hohe Empfindlichkeit der Methode auch Unterschiede zwischen einzelnen Rassen oder
Proben verschiedener geographischer Herkunft auftreten können. Durch die Verwendung geeigneter Vergleichsmaterialien ist eine eindeutige Zuordnung möglich.
Zusammenfassung
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Eigenschaften und Vorteile der SIAM- Methode bei der Tierartbestimmung aus Haaren, Federn und verwandten Strukturen:
- hohe Sensitivität: es werden weniger als 10 µg Probenmaterial benötigt
- unabhängig von morphologischen Strukturen
- unabhängig von DNA und RNA
- unabhängig von löslichen Proteinen
- hohe Spezifität: alle bisher untersuchten Tierarten konnten identifiziert werden
- hohe Zuverlässigkeit: bisher in mehr als 10 000 Messungen getestet
- schnelle Durchführbarkeit erlaubt einen hohen Probendurchsatz
- Quantifizierung nach Gewicht in binären Systemen ( zwei Tierarten ) möglich
Identification and Quantification of Feathers, Down, and Hair of Avian and Mammalian Origin Using Matrix-Assisted
Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry
Klaus Hollemeyer, Wolfgang Altmeyer and Elmar Heinzle
Anal. Chem.; 2002; 74 (23) pp 5960 - 5968; (Article)
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ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN DER SIAM-METHODE IM TIER- UND ARTENSCHUTZ
:::> Der illegale Handel mit geschützten Tieren und deren Produkten stellt den Tier- und Artenschutz vor große Probleme. Der Wert der illegal gehandelten Ware wird jährlich auf mehrere Milliarden US- Dollar geschätzt.
:::> Durch das Geschäft mit vom Aussterben bedrohten Tieren und Tierprodukten wie Fellen und Pelzen, aber auch
durch die Verwendung von Tieranteilen in der traditionellen asiatischen Medizin (Rhinozeros- Horn, Tigerknochen) sind viele Arten stark gefährdet.
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Ernstzunehmenden Recherchen zufolge hat auch der Handel mit Hunde- und Katzenfellen inzwischen riesige Ausmaße angenommen. Haustiere werden zu Hunderttausenden gezüchtet und auf grausame Weise getötet, um zu Pelz
verarbeitet zu werden. Diese Pelze werden dann unter falscher Bezeichnung illegal in den Handel gebracht. Es wird geschätzt, daß jährlich mehrere hunderttausend Felle so ihren Weg in die Geschäfte finden.
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Tierschutzorganisationen, nationale und internationale Verbände des Pelzhandels sowie behördliche Stellen sind daran interessiert, solche illegalen Praktiken zu verbieten oder zumindest eine eindeutige Kennzeichnung für gewisse
Produkte durchzusetzen. Ein wichtiges Problem stellt hierbei oft die eindeutige Identifizierung dar.
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SIAM erlaubt die schnelle und sichere Identifizierung von Haar- und Federproben. Sowohl das große Interesse, das
die Vorstellung der Methode in der weltweiten Presse hevorgerufen hat, als auch eine Vielzahl von Anfragen zeigen die Notwendigkeit einer solchen Analysenmethode.
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Um die Methode einer optimalen Nutzung zugänglich zu machen hat sich die SIAM- Arbeitsgruppe entschlossen, in Zusammenarbeit mit interessierten Verbänden und Behörden eine umfassende Bibliothek von Tierarten zu erstellen, die
es erlaubt, Haar- und Federproben schnell und sicher zu identifizieren. Eine herausragende Rolle spielt hierbei die
Verwendung eindeutiger Referenzmaterialien, welche die Charakterisierung der einzelnen Tierarten erlauben und somit eine schnelle und zuverlässige Rasteruntersuchung ermöglichen.
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Bereits heute erlaubt die Methode die Zuordnung von Proben, die im direkten Vergleich zu Vergleichsmaterialien
untersucht werden. So bereitet z. B. die Unterscheidung von Katzen- und Kaninchenfellen keinerlei Probleme. Aber auch
differenziertere Analysen sind bei Vorlage geeigneter Standards ohne Weiteres durchführbar. Alle bisher getesteten Tierarten, auch nahe verwandte Arten, konnten eindeutig und zuverlässig bestimmt werden.
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Tierartbestimmung aus Federn und Daunen mittels SIAM
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Im Rahmen der Kennzeichnung der Zusammensetzung von fertig bearbeiteten Federn und Daunen als alleiniges Füllmaterial spielt die Angabe der Tierarten eine wichtige Rolle (EN 12934:1999).
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Die akkurate Bestimmung mittels visueller Merkmale ist bei der mikroskopischen Untersuchung stark von der Erfahrung des Prüfers abhängig. Aufgrund fehlender morphologischer Merkmale verbleibt bei Anwendung dieses
Verfahrens immer ein Rest von nicht identifizierbaren Federn und Daunen, was die Genauigkeit der Analyse je nach Zusammensetzung der Proben zum Teil beträchtlich einschränkt.
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Zusätzliche Schwierigkeiten treten auf, wenn zwischen nahe verwandten Arten differenziert werden muß, i.e. Ente und Eiderente. Aufgrund der Ähnlichkeit der morphologischen Strukturen ist die eindeutige Zuordnung auch für
erfahrene Prüfer oft mit großen Problemen verbunden.
:::> Die vom Gene- Facts Analyselabor in Zusammenarbeit mit dem Institut für Technische Biochemie der Universität
Saarbrücken entwickelte SIAM- Methode bietet die Möglichkeit einer eindeutigen Charakterisierung aller Probenbestandteile und deren Quantifizierung. Aufgrund der hohen Sensitivität und Zuverlässigkeit, die in mehreren
Versuchsreihen bestätigt wurde, ist das Verfahren in der Lage, eine Genauigkeit größer 99 % zu erreichen.
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In einem ersten Schritt werden die vorliegenden Proben nach dem klassischen mikroskopischen Verfahren analysiert. Alle sicher bestimmbaren Elemente werden getrennt gesammelt und gewogen.
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Nicht bestimmbare Anteile werden einer Untersuchung mittels der SIAM- Methode unterzogen. Um eine exakte Quantifizierung zu gewährleisten werden hierzu kleinste Anteile der Federn und Daunen verwendet, so daß das
Gesamtgewicht der Probenanteile praktisch unverändert bleibt. Nach der eindeutigen Zuordnung und dem Wiegen der
Einzelelemente wird der Massenanteil der Tierarten getrennt für Federn und Daunen berechnet. Eventuell vorhandene Anteile von Landgeflügel werden getrennt ausgewiesen.
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Um die Anwendung der Methode zu optimieren und einen hohen Probendurchsatz zu gewährleisten untersucht die SIAM- Arbeitsgruppe zur Zeit die Möglichkeit der Quantifizierung direkt aus Feder- und Daunenmischungen. Bisherige
Erfahrungen erlauben die Bestimmung von Enten und Gänsen bis zu einem Grenzwert von ca. 2 %. Anteile von Landgeflügel können detektiert, bisher jedoch nicht ausreichend quantifiziert werden. Bis zur ausreichenden Validierung
der Mischungs- Quantifizierung werden die Proben nach dem oben beschriebenen Verfahren mit höchster Genauigkeit analysiert.
Das Gene-Facts Analyselabor ist assoziiertes Mitglied von EDFA und VDFI. IDFB- anerkanntes Prüfinstitut.
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Tierartbestimmung aus Haarmischungen und Textilien, Identifizierung und Quantifizierung
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Bei der Verarbeitung edler Tierhaare wie z. B. Cashmere, Camel und, Mohair stellt die Beimischung minderwertiger Fasern die Textilindustrie vor große Probleme. Diese Haare lassen sich, insbesondere in Mischungen mehrerer
Komponenten, nicht immer eindeutig identifizieren. Eine sichere Quantifizierung der einzelnen Tierarten ist mit den bisher zur Verfügung stehenden Methoden nicht in ausreichendem Maße gewährleistet.
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Erschwerend kommt hinzu, daß Haare vor der Beimischung oft bearbeitet und prozessiert werden (Bleichung, Färbung etc.), was die Identifizierung zusätzlich kompliziert.
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Im Rahmen dieser Problematik scheint die SIAM- Methode geeignet, einige dieser Schwierigkeiten zu bewältigen. Da sich die Methode und insbesondere die Anwendung auf verschiedenen Gebieten teilweise noch in der Entwicklung
befindet soll hier der heutige Stand der Technik kurz erläutert werden.
Identifizierung von Tierarten
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Die Identifizierung von Tierarten in Mischungen verschiedener Haare ist nach den bisherigen Erfahrungen sicher durchzuführen. Untersucht wurden bisher Gemische aus bis zu drei verschiedenen Arten. Die Nachweisgrenze für die
einzelnen Spezies liegt bei etwa 1 %. Komplexere Mischungen stehen zur Untersuchung an.
:::> Die Palette der bisher in diesem Rahmen analysierten Haare ist auf folgende, für die Textilindustrie relevanten Arten
beschränkt:
- Cashmere (white, brown)
- Llama/ Alpaca (white, brown, dark)
- Mohair
- Schafwolle
- Yak / Baby- Yak
- Camel
Weitere Arten werden nach Erhalt geeigneter Referenzmaterialien erfolgen. Gezielte
Untersuchungen sind bei Bereitstellung entsprechend dokumentierten Materials auf Anfrage möglich.
:::> Bisherige Analysen gefärbter und gebleichter Haare ließen die Erkennung der Tierart ohne
größere Schwierigkeiten zu. Es liegen jedoch keine Informationen vor, die eine Aussage über die angewandten Färbe- und Bleichmethoden zulassen. Um diese Problematik zu standardisieren ist
es notwendig, geeignetes Referenzmaterial in die Untersuchungen mit einzubeziehen.
:::> Das Problem der Vorbehandlung wird insbesondere bei der Ausschlußanalyse bedeutsam.
Läßt sich bei der Positivkontrolle relativ einfach nachweisen, ob Haare einer bestimmten Tierart verwendet wurden, so ist eine solche Aussage im Negativverfahren nicht immer eindeutig zu
treffen. Es besteht die Möglichkeit, daß Haare aufgrund angewandter Behandlungen in ihrer Charakteristik so verändert werden, daß ein Nachweis nicht zu führen ist. Voraussetzung für
den Ausschluß ist dann, daß die Behandlungsmethode bekannt und geeignetes Referenzmaterial vorhanden ist, um auch veränderte Carakteristika zu definieren und zu identifizieren.
Quantifizierung von Haaren aus Mischungen
:::> Bisher wurden Versuche zur Quantifizierung nur in binären Systemen durchgeführt. Erste
Ergebnisse sind in den nachfolgenden Diagrammen dokumentiert. SIAM eignet sich zum Nachweis des quantitativen Anteils (Gewichtsprozent) der eingesetzten Haare in Mischungen
aus zwei Tierarten. Neueste Untersuchungen zeigen, daß bei entsprechender Validierung auch mehrere Tierarten quantifiziert werden können; die Versuchsreihen sind jedoch noch nicht abgeschlossen.
:::> Um die Präzision der Messungen weiter zu verbessern sind erweiterte Analysemethoden in
der Erprobung. Ziel ist es, Aussagen im Bereich von ± 1 - 2 % zu ermöglichen.
:::> Auch bei der Quantifizierung muß die Problematik einer eventuellen Vorbehandlung in
Betracht gezogen werden.
  
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